OECD测试指南第442C(DPRA)：直接肽反应性测定
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1. 背景
1.1 适用范围和局限性
DPRA旨在通过定量测定受试化学物与含赖氨酸或半胱氨酸的模型合成肽的反应性，来解决皮肤致敏性AOP的分子起始事件，即蛋白质反应性, 使用半胱氨酸和赖氨酸肽耗竭百分比值将物质归类为四种反应性类别之一，以支持皮肤致敏物与非致敏物的区分。
与LLNA结果相比，DPRA区分致敏物（即UN GHS 1类）与非致敏物的准确性为80%（N=157），敏感性为80%（88/109），特异性为77%（37/48）
DPRA更可能低估显示低至中等皮肤致敏效力（即UN GHS 1B子类别）的化学物质，而不是显示高皮肤致敏效力（即UN GHS 1A子类别）的化学物质。基于现有整体数据，DPRA已显示适用于覆盖多种有机官能团、反应机制、皮肤致敏效力（通过体内研究确定）和理化性质的受试化学物
本测试方法不适用于测试金属化合物，因为已知它们通过共价结合以外的机制与蛋白质反应。受试化学物应可溶于适当溶剂中，最终浓度为100 mM，DPRA被认为在技术上适用于测试多组分物质和已知组成的混合物
不与肽共价结合但促进其氧化（即半胱氨酸二聚化）的受试化学物可能导致肽耗竭的潜在高估，从而导致可能的假阳性预测和/或被分配到更高的反应性类别
1.2 测试原理
DPRA是一种体外化学方法，可定量测定受试化学物在22.5-30°C孵育24小时后半胱氨酸或赖氨酸含肽的剩余浓度。合成肽含有苯丙氨酸以辅助检测。相对肽浓度通过高效液相色谱（HPLC）梯度洗脱和220 nm UV检测测量。然后计算半胱氨酸和赖氨酸肽耗竭百分比值，并在预测模型中使用，该模型允许将受试化学物分配到四种反应性类别之一，用于支持致敏物与非致敏物的区分
Ac-RFAACAA-COOH骨架如何理解
- N端封闭：序列起始于乙酰基(Acetyl group) 它连接在第一个氨基酸（精氨酸）的氮原子上，模拟了蛋白质内部的环境，消除了N端的正电荷
- 序列中的 R-F-A-A-C-A-A 通过肽键 (
−CO−NH−) 依次串联 - 丙氨酸 (A) 骨架主要作用是作为“填充物”维持肽链的螺旋倾向性和疏水性，不参与化学反应
| 氨基酸 | 单字母 | 侧链结构 | 作用与位置 |
|---|---|---|---|
| 精氨酸 | R | \(-(CH_2)_3-NH-C(NH)NH_2\) (胍基) | 位置 1。带强正电荷，增加水溶性，防止多肽聚集。 |
| 苯丙氨酸 | F | \(-CH_2-C_6H_5\) (苄基) | 位置 2。含苯环，提供疏水核心，模拟蛋白质内部的疏水环境。 |
| 半胱氨酸 | C | \(-CH_2-SH\) (巯基) | 位置 5 (核心)。这是反应靶点。巯基上的硫原子具有强亲核性，会攻击致敏剂。 |
Ac-RFAACAA-COOH 的骨架是一个乙酰化封闭的七肽链，其核心在于第5位的半胱氨酸残基，它被包裹在由精氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸构成的模拟蛋白环境中，专门用于“诱捕”亲电性化学物质
Ac-RFAAKAA-COOH骨架也是同样的原理
- 靶心：K (赖氨酸) —— 绝对主角
- 化学结构：赖氨酸的侧链是一个长链，末端有一个 ε-氨基 ( −NH 2)
- 这个氨基具有亲核性。当遇到某些特定的致敏化学物质（比如醛类、酮类或某些酰化剂）时，这个氮原子会发起攻击，与化学物质形成共价键，从而耗竭肽链
| 特征 | Ac-RFAACAA (半胱氨酸肽) | Ac-RFAAKAA (赖氨酸肽) |
|---|---|---|
| 反应原子 | 硫 (S) | 氮 (N) |
| 化学性质 | 硫原子非常“软”，反应活性极高 | 氮原子相对“硬”，反应活性稍低 |
| 捕捉对象 | 捕捉大多数强致敏剂 (如丙烯酰类) | 捕捉特定的致敏剂 (如醛类、某些卤代物) |
| 地位 | 主力军 (绝大多数致敏剂都攻击它) | 补漏者 (防止漏掉那些不攻击硫、只攻击氮的化学物质) |
1.3 熟练度测试化合物
| 熟练度物质 | CASRN | 物理状态 | 体内预测¹ | DPRA预测² | 半胱氨酸肽耗竭%范围³ | 赖氨酸肽耗竭%范围³ |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 2,4-二硝基氯苯 | 97-00-7 | 固体 | 致敏物（极强） | 阳性 | 90-100 | 15-45 |
| 噁唑酮 | 15646-46-5 | 固体 | 致敏物（极强） | 阳性 | 60-80 | 10-55 |
| 甲醛 | 50-00-0 | 液体 | 致敏物（强） | 阳性 | 30-60 | ≤ 24 |
| 苄叉丙酮 | 122-57-6 | 固体 | 致敏物（中等） | 阳性 | 80-100 | ≤ 7 |
| 法尼醛 | 19317-11-4 | 液体 | 致敏物（弱） | 阳性 | 15-55 | ≤ 25 |
| 2,3-丁二酮 | 431-03-8 | 液体 | 致敏物（弱） | 阳性 | 60-100 | 10-45 |
| 1-丁醇 | 71-36-3 | 液体 | 非致敏物 | 阴性 | ≤ 7 | ≤ 5.5 |
| 6-甲基香豆素 | 92-48-8 | 固体 | 非致敏物 | 阴性 | ≤ 7 | ≤ 5.5 |
| 乳酸 | 50-21-5 | 液体 | 非致敏物 | 阴性 | ≤ 7 | ≤ 5.5 |
| 4-甲氧基苯乙酮 | 100-06-1 | 固体 | 非致敏物 | 阴性 | ≤ 7 | ≤ 5.5 |
¹体内危害和（效力）预测基于LLNA数据,体内效力使用ECETOC提出的标准推导
²DPRA预测应在DA或IATA框架内考虑
³范围基于6个独立实验室产生的至少10个耗竭值确定
2. 测试方法
如果使用替代HPLC设置，应证明其与DB-ALM方案所述验证设置的等效性（例如通过 表 1 中的熟练度物质）
2.1 含半胱氨酸或赖氨酸肽的制备
- 半胱氨酸（Ac-RFAACAA-COOH）和赖氨酸（Ac-RFAAKAA-COOH）含合成肽的储备溶液（纯度高于85%，最好>90%）应在其与受试化学物孵育前新鲜配制
- 半胱氨酸肽的最终浓度应为pH 7.5磷酸缓冲液中的0.667 mM，而赖氨酸肽的最终浓度应为pH 10.2乙酸铵缓冲液中的0.667 mM