体外3T3 NRU光毒性测试标准操作程序 (SOP)

OECD 测试指南 432

本标准操作程序（SOP）描述了体外3T3中性红摄取（NRU）光毒性测试方法，用于识别经光激活的受试化学品的光毒性潜力。
Author

基于OECD TG 432 (2019)

Published

February 28, 2026

测试方法介绍

方法验证历史与背景

本测试方法是经正式验证的体外方法，用于评估化学品的光细胞毒性。

验证状态

该方法是欧盟替代方法验证中心（ECVAM）于1995-1998年间协调进行的国际验证研究的成果。验证过程遵循OECD系列测试与评估文件No. 34所述的原则（OECD Series on Testing and Assessment No. 34: The Validation of Test Methods）。

方法发展历程

  • 1995年：该方法基于CVMP/EU/CVMP/032/95文件首次通过
  • 1996-1998年：进行全面的实验室间验证研究
  • 2000年：被欧盟批准为化妆品成分光毒性筛选的替代方法
  • 2004年：首次被OECD采纳为测试指南432
  • 2019年：最新版本更新，进一步明确了接受标准和决策标准

与其他验证方法的关系

本方法与其他验证的光毒性测试方法相互补充：

方法 全称 主要应用
3T3 NRU PT 3T3细胞中性红摄取光毒性测试 细胞活力测试（本方法）
RSM 红细胞光溶血测试 红细胞膜光损伤评估
3T3 NRU PT + RSM 组合策略 提高预测准确性的整合方法

验证研究结论

根据OECD验证研究，该方法具有以下特点：

  • 高预测能力：敏感性≥95%，特异性≥80%
  • 良好的重现性：实验室间变异系数低
  • 广泛的适用性：适用于多种化学类别
  • 动物福利优势：完全替代动物进行的光毒性测试

参考文献与验证文档

  • OECD Series on Testing and Assessment No. 34
  • CVMP/EU/CVMP/032/95 (1995)
  • Holzhütter, H.G. et al. (1996). ATLA 24: 741-758

概述

1. 目的

本标准操作程序（SOP）描述了体外3T3中性红摄取（NRU）光毒性测试方法，用于：

  • 识别经光激活的受试化学品的光毒性潜力
  • 评估化学品在光照和非光照条件下的细胞毒性差异
  • 预测化学品在体内的光毒性效应

2. 原理

体外3T3 NRU光毒性测试基于比较化学品在有光照和无光照条件下的细胞毒性：

  • 细胞毒性通过中性红（NR）摄取量的浓度依赖性降低来评估
  • 中性红（NR）是一种弱阳离子染料，可通过非离子扩散穿透细胞膜并积聚在溶酶体中
  • 光毒性机制：光毒剂通过产生活性氧（ROS）等机制导致溶酶体膜通透性增加、pH梯度降低等不可逆变化
  • 测试时间：在处理和照射后18-24小时测量NR摄取量

3. 适用范围

3.1 测试化学品类型

适用于可能诱导光毒性效应的化学品，包括：

  • 局部给药的化妆品成分
  • 系统给药后分布到皮肤/眼睛的药物
  • 可能暴露于环境光的其他化学品

3.2 不适用情况

本测试不设计用于预测：

  • 光基因毒性
  • 光过敏
  • 光致癌性
  • 间接光毒性机制
  • 代谢产物的效应
  • 混合物的效应

初始考虑和限制

在进行本测试之前，应仔细考虑以下因素，以确保测试的科学有效性和结果的合理解释。

1. 测试方法的主要局限性

1.1 UV/vis吸收预筛选要求

关键要求：只有当化学品在290-700 nm范围内具有显著UV/vis吸收时，才应进行光毒性测试。

吸收阈值：

  • 摩尔消光系数（MEC）> 1000 L mol⁻¹ cm⁻¹
  • 在该范围内任何波长处超过此阈值

意义：

  • 如果化学品无显著UV/vis吸收，其光激活的可能性极低
  • 预筛选可以避免不必要的动物替代测试
  • 符合3R原则（减少、优化、替代）

1.2 代谢产物不被测试

局限性：

  • 本体外测试系统不包含代谢激活系统
  • 化学品的体内代谢产物可能具有光毒性
  • 对于主要经代谢激活产生光毒性的化学品，结果可能为假阴性

建议：

  • 如果已知或怀疑代谢产物具有光毒性潜力：
    • 考虑使用添加S9混合物的体外测试
    • 进行动物试验（仅在体外测试不可行时）
    • 使用皮肤模型测试

1.3 化学品混合物

局限性：

  • 本方法不适用于化学品混合物
  • 混合物成分可能相互干扰（吸收、淬灭、协同或拮抗作用）

建议：

  • 对混合物的各组分分别测试
  • 如需测试完整配方，考虑其他方法（如3D皮肤模型）

1.4 UV吸收晶体的测试局限性

问题：

  • 在测试浓度下形成UV吸收晶体的化学品
  • 晶体沉淀可能导致假阳性或假阴性结果

判断标准：

  • 通过肉眼或显微镜观察测试溶液中的晶体形成
  • 如果在接近IC₅₀浓度观察到晶体，需谨慎解释结果

处理方法：

  • 降低测试浓度（如果有足够的数据）
  • 使用助溶剂提高溶解度
  • 在报告中注明晶体形成情况

1.5 水不稳定性化学品

问题：

  • 在水溶液中快速降解的化学品可能产生假阴性
  • 测试期间（60分钟处理 + 50分钟照射）的稳定性是关键

建议：

  • 对于已知水不稳定性的化学品，考虑缩短照射时间
  • 使用非水缓冲系统（如果兼容）
  • 在报告中说明不稳定性问题

2. 方法选择指导

2.1 整合测试策略（IATA）

根据OECD 2024年发布的《光毒性测试整合测试与评估策略指导文件》，建议采用以下分层策略：

第1层：物理化学数据收集

  → UV/vis吸收光谱（290-700 nm）
  → 如MEC < 1000 L mol⁻¹ cm⁻¹，无需进一步测试

第2层：体外光毒性测试

  → 3T3 NRU光毒性测试（本方法）
  → 评估PIF和MPE值

第3层：补充测试（如需要）

  → ROS（活性氧）生成试验
  → 3D皮肤模型测试
  → 其他确认性试验

3. 测试流程决策树

flowchart TD
    A[开始：评估化学品] --> B[收集UV/vis吸收数据<br/>290-700 nm范围]
    B --> C{MEC > 1000 L mol⁻¹ cm⁻¹?}
    C -->|否| D[无需光毒性测试<br/>无光毒性潜力]
    C -->|是| E[进行体外3T3 NRU光毒性测试]
    E --> F{检查测试局限性}
    F --> G[考虑代谢激活需求]
    F --> H[检查溶解度和稳定性]
    F --> I[评估是否为混合物]
    G --> J[执行测试<br/>记录所有观察]
    H --> J
    I --> J
    J --> K[计算PIF和MPE]
    K --> L{PIF > 5 或 MPE > 0.15?}
    L -->|是| M[光毒性阳性]
    L -->|否| N{PIF < 2 或 MPE < 0.1?}
    N -->|是| O[光毒性阴性]
    N -->|否| P[结果不确定<br/>考虑补充测试]

4. 结果解释的特殊考虑

4.1 仅在最高浓度观察到光毒性

情况描述：

  • 仅在最高测试浓度观察到PIF > 2
  • 该浓度接近或高于实际暴露水平

处理建议：

  • 评估皮肤吸收数据：如果化学品皮肤吸收率低，实际风险可能较低
  • 评估皮肤蓄积：考虑化学品在皮肤中的蓄积潜力
  • 考虑其他测试：
    • ROS（活性氧）生成试验
    • 3D皮肤模型测试
    • 体外动物皮肤或人体皮肤试验

4.2 可疑/边界结果

情况描述：

  • PIF在2-5之间，或MPE在0.1-0.15之间
  • 测试条件不理想（如晶体形成、溶剂毒性等）

处理建议：

  • 重复测试：使用改进的实验条件
  • 调整实验参数：
    • 浓度范围或间距
    • 培养时间
    • 照射时间（对于水不稳定性化学品可使用更短时间）
  • 进行补充测试：
    • 不同阳性对照验证系统性能
    • 使用其他体外方法（如RSM）
    • 考虑3D皮肤模型

测试方法摘要

方法概述

体外3T3 NRU光毒性测试是一种经过验证的体外方法，通过比较有光照和无光照条件下化学品对细胞的毒性差异来评估其光毒性潜力。

测试系统

组件 描述
细胞系 BALB/c 3T3（克隆A31）小鼠成纤维细胞
检测终点 中性红（NR）摄取量
测试条件 有光照（+Irr）vs 无光照（-Irr）
照射剂量 5 J/cm² UVA（非细胞毒性剂量）
测试时间 3天（铺板→处理→检测）

参考物质

阳性对照（光毒性物质）

下表列出了验证研究中使用的光毒性化学品及其预期结果范围：

化学品名称（英文） 化学品名称（中文） CAS号 预期PIF范围 预期MPE范围 光毒性
Amiodarone HCl 胺碘酮盐酸盐 19774-82-4 > 3.25 0.27-0.54 是
Chlorpromazine HCl 氯丙嗪盐酸盐 69-09-0 > 14.4 0.33-0.63 是
Norfloxacin 诺氟沙星 70458-96-7 > 71.6 0.34-0.90 是
Anthracene 蒽 120-12-7 > 18.5 0.19-0.81 是
Protoporphyrin IX Disodium 原卟啉IX二钠 50865-01-5 > 45.3 0.54-0.74 是

阴性对照（非光毒性物质）

化学品名称（英文） 化学品名称（中文） CAS号 预期PIF范围 预期MPE范围 光毒性
L-Histidine L-组氨酸 70-00-4 < 1 0.05-0.10 否
Hexachlorophene 六氯酚 70-30-4 1.0-1.7 0.00-0.05 否
Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠 151-21-3 1.0-1.9 0.00-0.05 否

推荐常规阳性对照

氯丙嗪（Chlorpromazine, CPZ）是推荐的常规阳性对照物质：

  • 可靠的光毒性反应
  • 良好的溶解性
  • 稳定的光反应特性

  • 充分的历史数据支持

材料与试剂

1. 细胞系

1.1 BALB/c 3T3细胞（克隆A31）

细胞系信息：

属性 规格
细胞类型 小鼠成纤维细胞
克隆 A31
物种 Mus musculus（小鼠）
组织来源 胚胎成纤维细胞

细胞系来源：

必须从认可的细胞库获取：

  • ATCC（American Type Culture Collection）
    • 目录号：CCL-163
    • 地址：10801 University Blvd, Manassas, VA 20110, USA
    • 网址：www.atcc.org
  • ECACC（European Collection of Authenticated Cell Cultures）
    • 目录号：93061404
    • 地址：Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JG, UK
    • 网址：www.phe-culturecollections.org.uk

重要说明：

  • 仅使用来自上述认可来源的细胞
  • 不得使用来源不明或未经鉴定的细胞
  • 保留细胞系鉴定和来源文件

1.2 细胞质量控制

1.2.1 支原体检测

要求：

  • 细胞到达实验室时立即检测
  • 仅当检测结果为阴性时才使用
  • 之后每3-6个月定期检测

检测方法：

  • PCR法（推荐，快速且敏感）
  • 培养法（金标准，但需时较长）
  • DNA染色法（Hoechst 33258染色）

如果检测阳性：

  1. 立即停止使用该批细胞
  2. 对培养环境进行彻底清洁和消毒
  3. 从主细胞库复苏新细胞
  4. 确认无污染后重新开始使用

1.2.2 UV敏感性检查

目的：

验证特定代次的细胞对照射具有适当的敏感性，能够正确区分光毒性和非光毒性化学品。

要求：

  • 对工作细胞库（WCB）至少检查一次
  • 在最高使用代次进行测试
  • 使用递增剂量照射（包括高于测试使用的剂量）

测试方法：

  1. 准备细胞（标准铺板密度）
  2. 用不同剂量的UVA照射（例如：1, 3, 5, 7 J/cm²）
  3. 测定细胞活力（中性红摄取法）
  4. 确认最高非细胞毒性剂量（应≥ 5 J/cm²）

接受标准：

  • 5 J/cm²剂量应导致最小或无细胞毒性
  • 5 J/cm²剂量下，阳性对照（CPZ）的PIF应 > 6
  • 阴性对照（如L-组氨酸）的PIF应 < 2

如果UV敏感性异常：

  • 检查光源校准
  • 检查细胞状态和代次
  • 考虑从更低代次复苏细胞
  • 重新进行UV敏感性验证

1.2.3 细胞身份鉴定

要求：

  • 定期进行细胞身份鉴定（至少每年1次）
  • 使用STR图谱分析（短串联重复序列分析）
  • 与ATCC或ECACC的参考图谱比较

目的：

  • 防止细胞系交叉污染
  • 防止细胞系误认
  • 确保实验数据的可追溯性

1.2.4 细胞形态检查

日常检查：

每次细胞传代时，应在显微镜下检查：

  • 形态：成纤维细胞典型的梭形、纺锤形
  • 贴壁性：良好贴壁，无大量漂浮细胞
  • 生长状态：对数生长期，密度均匀
  • 异常：无空泡化、无多核巨细胞、无异常颗粒

如果发现异常：

  1. 停止使用该批细胞
  2. 检查培养条件（pH、温度、CO₂）
  3. 检查培养基质量（批号、储存）
  4. 必要时从细胞库复苏新细胞

1.3 细胞代次管理

代次限制：

细胞库 代次范围 用途
主细胞库（MCB） 低代次（通常< 20代） 长期储存，原始来源
工作细胞库（WCB） 中等代次（通常< 40代） 日常实验的细胞来源
实验使用 < 100代（优选< 60代） 测试用细胞

代次记录：

  • 详细记录每次传代的日期和代次
  • 在测试报告中记录使用的细胞代次范围
  • 建立代次与测试性能的关系数据库

建议：

  • 定期（如每20代）从WCB复苏新细胞
  • 避免长时间连续传代
  • 监控高代次细胞的性能变化

1.4 细胞库管理

1.4.1 主细胞库（Master Cell Bank, MCB）

建立：

  • 从认可的细胞库（ATCC/ECACC）获取
  • 在尽可能低的代次建立
  • 分装成小体积（如1 mL/管）
  • 使用含10% DMSO的完全培养基作为冻存液

储存：

  • 储存在液氮气相（-150°C至-180°C）
  • 避免液氮液相储存（有污染风险）
  • 使用专门的液氮罐，清晰标识

质量控制：

  • 支原体检测阴性
  • 细胞身份鉴定确认
  • 细胞活力 > 90%（复苏后）
  • UV敏感性检查合格

1.4.2 工作细胞库（Working Cell Bank, WCB）

建立：

  • 从MCB复苏一瓶细胞
  • 扩增至足够数量
  • 分装冻存（如50-100管）
  • 记录详细的代次信息

使用原则：

  • 从WCB复苏细胞进行日常实验
  • 避免直接从MCB频繁取用
  • WCB用完后，从MCB建立新的WCB

定期更新：

  • 建议每1-2年建立新的WCB
  • 确保WCB细胞的代次不会太高

1.5 细胞培养最佳实践

1.5.1 传代操作

建议传代比例：1:3至1:6

传代频率：根据生长速度，通常每2-3天传代一次

关键要点：

  • 避免细胞过度汇合（> 80%汇合度）
  • 避免细胞长期低密度培养
  • 保持一致的传代方案
  • 使用无菌技术，防止污染

1.5.2 培养基更换

频率：每2-3天更换一次，或根据pH指示剂颜色变化

注意事项：

  • 预温培养基至37°C
  • 避免pH剧烈变化
  • 不要让培养基过酸（变黄）

1.5.3 冷冻复苏

复苏步骤：

  1. 快速解冻（37°C水浴，1-2分钟）
  2. 立即转移至预温的完全培养基
  3. 离心去除DMSO（可选）
  4. 重悬于新鲜培养基
  5. 接种至T-75培养瓶

冷冻步骤：

  1. 选择对数生长期细胞
  2. 胰酶消化，计数
  3. 调整细胞浓度（如1×10⁶ cells/mL）
  4. 加入等体积的2×冻存液（含20% DMSO）
  5. 分装至冻存管
  6. 使用程序降温盒或Mr. Frosty冷冻
  7. -80°C过夜后转移至液氮

2. 培养基与试剂

2.1 完全培养基

组分 浓度
DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基） 基础培养基
新生小牛血清 10% (v/v)
L-谷氨酰胺 4 mM
青霉素 100 IU/mL
链霉素 100 μg/mL

培养条件：

  • 温度：37°C
  • CO₂：5-7.5%（根据缓冲系统调整）
  • 湿度：≥95%

2.2 缓冲盐溶液

选择以下之一：

  • EBSS（Earle平衡盐溶液）
  • HBSS（Hanks平衡盐溶液）

要求：

  • 不含蛋白成分
  • 不含光吸收成分（如酚红、维生素）
  • pH稳定（避免照射50分钟期间pH升高）

2.3 中性红溶液

配制（50 μg/mL）(母液为 0.5mg/mL(10x))：

  • 中性红（3-氨基-7-二甲基氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐）
  • CAS号：553-24-2
  • C.I. 50040
  • 溶解于无血清培养基

注意事项：

  • 使用前预质量控制
  • 过滤或离心去除结晶
  • 可添加HEPES防止结晶

2.4 NR提取液（现配）

  • 49%去离子水
  • 50%乙醇
  • 1%冰醋酸

3. 受试化学品制备

3.1 溶剂选择

优先顺序：

  1. 缓冲盐溶液（EBSS/HBSS）
  2. DMSO（二甲亚砜）- 最高1% (v/v)
  3. 乙醇 - 最高1% (v/v)

溶剂评估要求：

  • 与受试化学品无反应
  • 不诱导光毒性
  • 不淬灭光毒性效应
  • 无自由基清除特性
  • 化学稳定性

3.2 溶解度

  • 涡旋混合
  • 超声处理
  • 适当温度加热（不影响稳定性）

3.3 储存

  • 测试当天新鲜配制（除非稳定性数据支持）
  • 避免预先光激活或降解

4. 阳性对照

4.1 推荐常规阳性对照

氯丙嗪（Chlorpromazine, CPZ）是推荐的常规阳性对照物质：

参数 可接受范围
CPZ (+Irr) IC₅₀ 0.1 - 2.0 μg/mL
CPZ (-Irr) IC₅₀ 7.0 - 90.0 μg/mL
PIF > 6

选择理由：

  • 可靠的光毒性反应
  • 良好的溶解性（在DMSO和缓冲液中）
  • 稳定的光反应特性
  • 充分的历史数据支持
  • 国际验证研究的标准阳性对照

4.2 能力验证化学品（表1完整版）

下表列出了验证研究中使用的化学品及其预期结果范围。初次建立本测试方法的实验室应测试表中的化学品以验证系统性能。

表1：能力验证化学品及其预期结果

序号 化学品名称（英文） 化学品名称（中文） CAS号 预期PIF范围 预期MPE范围 光毒性分类
1 Amiodarone HCl 胺碘酮盐酸盐 19774-82-4 > 3.25 0.27-0.54 阳性
2 Chlorpromazine HCl 氯丙嗪盐酸盐 69-09-0 > 14.4 0.33-0.63 阳性
3 Norfloxacin 诺氟沙星 70458-96-7 > 71.6 0.34-0.90 阳性
4 Anthracene 蒽 120-12-7 > 18.5 0.19-0.81 阳性
5 Protoporphyrin IX Disodium 原卟啉IX二钠 50865-01-5 > 45.3 0.54-0.74 阳性
6 L-Histidine L-组氨酸 70-00-4 < 1 0.05-0.10 阴性
7 Hexachlorophene 六氯酚 70-30-4 1.0-1.7 0.00-0.05 阴性
8 Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠 151-21-3 1.0-1.9 0.00-0.05 阴性

化学品详细信息

阳性化学品：

  1. 胺碘酮盐酸盐（Amiodarone HCl）
    • 类型：抗心律失常药物
    • 作用机制：UVA吸收，产生活性氧
    • 特点：强光毒性，常作为确认阳性对照
  2. 氯丙嗪盐酸盐（Chlorpromazine HCl）
    • 类型：抗精神病药物
    • 作用机制：吩噻嗪类结构，光敏化作用
    • 特点：推荐常规阳性对照
  3. 诺氟沙星（Norfloxacin）
    • 类型：氟喹诺酮类抗生素
    • 作用机制：UVA吸收，光降解产生毒性产物
    • 特点：非常高的PIF值，强光毒性
  4. 蒽（Anthracene）
    • 类型：多环芳烃
    • 作用机制：UVA吸收，形成单线态氧
    • 特点：难溶性，需特殊溶剂处理
  5. 原卟啉IX二钠（Protoporphyrin IX Disodium）
    • 类型：血红素生物合成中间体
    • 作用机制：内源性光敏剂类似物
    • 特点：极高光毒性，低浓度即可显示效应

阴性化学品：

  1. L-组氨酸（L-Histidine）
    • 类型：氨基酸
    • 特点：无UV吸收，生物学安全性高
    • 用途：阴性对照，验证系统特异性
  2. 六氯酚（Hexachlorophene）
    • 类型：抗菌剂
    • 特点：有细胞毒性但无光毒性
    • 用途：区分毒性和光毒性
  3. 十二烷基硫酸钠（SDS）
    • 类型：表面活性剂
    • 特点：膜损伤作用，但无光增强效应
    • 用途：阴性对照，常用溶剂添加剂

4.3 能力验证要求

初次建立测试的实验室应：

  1. 最低要求：
    • 测试至少5种化学品
    • 至少3种阳性化学品
    • 至少2种阴性化学品
  2. 性能标准：
    • 所有阳性化学品应正确识别为光毒性（PIF > 2或MPE > 0.1）
    • 所有阴性化学品应正确识别为非光毒性（PIF < 2且MPE < 0.1）
    • 敏感性（真阳性率）≥ 95%
    • 特异性（真阴性率）≥ 80%

仪器设备

1. 细胞培养设备

设备 规格
CO₂培养箱 37°C，5-7.5% CO₂，湿度≥95%
生物安全柜 II级A2型
倒置显微镜 相差功能
96孔板组织培养处理板 无菌、透明底
血球计数板 细胞计数
离心机 细胞沉淀用

2. 光照系统

2.1 光源（太阳模拟器）

推荐类型：

  1. 氙弧灯 - 与日光匹配最佳
  2. 掺杂金属卤化物弧灯 - 产热少、成本低

光谱要求：

  • 发射完整太阳光谱：290-700 nm
  • 经过滤后衰减UVB，允许UVA和可见光透过
  • 符合ISO D65标准（国际室外日光标准）

2.2 滤光器

功能：

  • 衰减高度细胞毒性的UVB波长（280-315 nm）
  • 允许UVA（315-400 nm）和可见光（400-700 nm）透过
  • 模拟环境光的光谱分布

类型选择：

滤光器类型 特点 应用
WG320滤光器 截止波长320 nm 标准配置
WG335滤光器 截止波长335 nm 进一步减少UVB
专用日光滤光器 符合ISO D65标准 最佳日光模拟

96孔板盖的过滤效应：

  • 大多数96孔板盖含有UV稳定剂
  • 这些稳定剂会额外吸收部分UVB和UVA
  • 重要：测量辐照度时，必须使用实际测试中使用的板盖类型

滤光器维护：

  • 定期清洁滤光器表面（使用无绒布和适当的清洁剂）
  • 检查滤光器是否有裂纹或划痕
  • 记录滤光器使用时间和更换日期
  • 建议每1-2年更换滤光器（取决于使用频率）

2.3 剂量测定设备

2.3.1 UVA计

要求：

  • 宽带UVA检测器（响应范围315-400 nm）
  • 定期校准（建议每年1次）
  • 通过实际使用的96孔板盖类型进行测量

测量方法：

  1. 准备工作：
    • 预热光源30分钟至稳定输出
    • 将UVA计探测器放置在96孔板位置
    • 覆盖实际使用的板盖类型
  2. 测量步骤：
    • 记录UVA辐照度读数（mW/cm²）
    • 在多个位置测量（至少5个点）
    • 计算平均辐照度和均匀度
  3. 均匀度要求：
    • 各位置辐照度变异系数（CV）应 < 10%
    • 如果CV > 10%，检查光源和反射系统

2.3.2 光谱辐射计

用途：

  • 测量完整的光谱分布（290-700 nm）
  • 验证滤光器的透射特性
  • 调整和验证UVA计的校准

使用频率：

  • 初始安装时：完整的光谱分析
  • 光源更换后：验证新光源的光谱特性
  • 年度检查：确认光谱分布未发生漂移
  • 性能异常时：排查问题

测量要点：

  1. 使用与日常测试相同的板盖
  2. 记录完整的UV/vis光谱（290-700 nm）
  3. 检查UVB（280-315 nm）是否被充分衰减
  4. 确认UVA（315-400 nm）的强度分布
  5. 验证符合ISO D65标准（如适用）

2.4 光源校准程序

2.4.1 日常校准（每次测试前）

目的：确保光源输出稳定在目标范围内

步骤：

  1. 预热光源：开启光源，预热至少30分钟
  2. 放置UVA计：将UVA计探测器放置在96孔板位置
  3. 覆盖板盖：使用实际测试的板盖类型
  4. 测量辐照度：记录至少3次读数，计算平均值
  5. 计算照射时间：

$ t (min) = $

示例：目标剂量5 J/cm²，测得辐照度1.7 mW/cm²

$ t = = = 49 $

  1. 记录结果：在实验记录表中记录辐照度和计算的时间

可接受范围：

  • 辐照度应在历史平均值的±15%范围内
  • 如果超出范围，检查光源或设备

3. 分析设备

设备 规格
酶标仪/分光光度计 540±10 nm测量波长
微孔板振荡器 提取NR用
移液器 0.1-1000 μL范围
多通道移液器 96孔板操作

操作步骤

第1天：细胞铺板

步骤1：制备细胞悬液

  1. 从工作细胞库复苏细胞或从传代培养中获取细胞
  2. 用完全培养基调整细胞密度至 1 × 10⁵ cells/mL
  3. 确保细胞处于对数生长期，活力>90%

步骤2：铺板

板类型 孔内容 体积
测试化学品板（+Irr） 100 μL细胞悬液 1×10⁴ cells/孔
测试化学品板（-Irr） 100 μL细胞悬液 1×10⁴ cells/孔
阳性对照板（+Irr） 100 μL细胞悬液 1×10⁴ cells/孔
阳性对照板（-Irr） 100 μL细胞悬液 1×10⁴ cells/孔
周边孔（空白） 100 μL完全培养基 -

要点：

  • 每种受试化学品需要2块板（+Irr和-Irr）
  • 阳性对照需要2块板
  • 周边孔加培养基作为空白对照

步骤3：培养

  • 将96孔板置于37°C，5-7.5% CO₂培养箱
  • 培养18-24小时
  • 直至形成约50%汇合单分子层
  • 此期间细胞恢复、贴壁并指数生长

第2天：化学品处理与照射

步骤4：制备受试化学品稀释系列

几何稀释系列（8个浓度）：

  1. 确定最高测试浓度：

    • 最大浓度：≤ 1000 μg/mL
    • 许多情况下可降至100 μg/mL
    • 对于不溶性化学品：使用最高可达到浓度

  2. 使用恒定稀释因子（例如：√10或2）

  3. 配制示例：

# 假设最高浓度为1000 μg/mL，使用1:3.16稀释
concentrations <- c(1000, 316, 100, 31.6, 10, 3.16, 1, 0.316) # μg/mL
  1. 在所选溶剂中制备8个储液
  2. 将储液转移至水性载体（EBSS/HBSS）用于加样
  3. 保持最终溶剂浓度恒定（通常1% v/v）

步骤5：处理细胞

  1. 吸去培养基
  2. 轻柔洗涤：每孔加入150 μL缓冲液，吸去
  3. 加入100 μL含相应浓度受试化学品的缓冲液
  4. 溶剂对照孔：加入含相同浓度溶剂的缓冲液
  5. 在暗处培养60分钟

步骤6：光照/避光处理

光照板（+Irr）：

  1. 在室温下通过板盖照射细胞
  2. 使用5 J/cm² UVA剂量（约50分钟）
  3. 确保温度控制在室温范围

避光板（-Irr）：

  1. 在室温下保持在暗处
  2. 时间与照射板相同（约50分钟）
  3. 可用铝箔包裹或放置暗盒中

步骤7：洗涤与恢复

  1. 吸去测试溶液
  2. 用缓冲液洗涤2次（每孔150 μL）
  3. 加入100 μL新鲜完全培养基
  4. 置于培养箱过夜培养（18-24小时）

第3天：中性红摄取测定

步骤8：显微镜检查

使用相差显微镜检查：

  • 细胞形态：观察形态学变化
  • 单分子层完整性：检查是否有脱落或空洞
  • 细胞生长：评估生长密度
  • 异常：记录任何异常现象

步骤9：中性红摄取

  1. 预温育缓冲液至37°C
  2. 吸去培养基，用150 μL温育缓冲液洗涤细胞
  3. 吸去缓冲液
  4. 加入100 μL中性红溶液（50 μg/mL，无血清培养基）
  5. 在37°C、5-7.5% CO₂条件下培养3小时

步骤10：洗涤与提取

  1. 吸去中性红培养基
  2. 用150 μL缓冲液洗涤细胞
  3. 吸去缓冲液，彻底去除残留液体（可倒扣在纸巾上或离心）
  4. 加入精确150 μL NR提取液
  5. 在微孔板振荡器上温和振荡至少10分钟
  6. 直至NR完全提取且溶液均匀

步骤11：吸光度测定

  1. 在540±10 nm波长下测量吸光度
  2. 使用空白孔（周边孔）作为参考
  3. 将数据保存为适当的电子文件格式以便后续分析

数据分析

1. 数据质量要求

1.1 接受标准

为确保测试结果的有效性和可靠性，每次测试都必须满足以下接受标准：

溶剂对照接受标准

检查项目 可接受标准 说明
溶剂对照细胞活力 照射的溶剂对照活力 ≥ 非照射溶剂对照的80% 确保光照本身不导致显著细胞毒性
溶剂对照OD₅₄₀ 平均OD₅₄₀ ≥ 0.4 约为背景溶剂吸光度的20倍，确保足够的信噪比
溶剂对照IC₅₀(-Irr) IC₅₀(-Irr) ≥ 最高测试浓度 溶剂在无光照条件下无显著毒性
溶剂对照IC₅₀(+Irr) IC₅₀(+Irr) ≥ 最高测试浓度 溶剂在有光照条件下无显著光毒性
溶剂对照PIF PIF < 2 溶剂本身不显示光毒性

阳性对照（氯丙嗪，CPZ）接受标准

检查项目 可接受范围 说明
CPZ IC₅₀(+Irr) 0.1 - 2.0 μg/mL 光照条件下显示显著细胞毒性
CPZ IC₅₀(-Irr) 7.0 - 90.0 μg/mL 无光照条件下毒性显著低于光照条件
CPZ PIF > 6 证实系统的光毒性检测能力

细胞生长质量控制

检查项目 可接受标准 说明
细胞倍增时间 1×10⁴ cells/孔应在48小时内正常倍增 确保细胞处于对数生长期
细胞形态 显微镜下形态正常，无异常变化 细胞健康状态良好
单分子层完整性 50%汇合度，无脱落或空洞 确保测试一致性

测试有效性总体评估

仅当所有上述标准均满足时，测试才被视为有效。

如果任何接受标准未满足：

  1. 识别失败原因
  2. 纠正问题
  3. 重新进行测试

常见失败原因及纠正措施：

失败项目 可能原因 纠正措施
溶剂对照活力 < 80% 溶剂浓度过高、培养条件不当 降低溶剂浓度、检查培养箱条件
溶剂对照OD₅₄₀ < 0.4 细胞数不足、NR提取不完全 调整细胞铺板密度、检查NR提取步骤
CPZ IC₅₀超出范围 试剂变质、照射剂量不当 使用新鲜试剂、校准光源
CPZ PIF ≤ 6 系统性问题 全面检查实验条件、重新验证系统

1.2 数据点要求

为了获得可靠的浓度-响应曲线：

  • 捕获完整的浓度-响应关系：

    • 有光照（+Irr）和无光照（-Irr）条件下的完整数据
    • 至少8个浓度点
    • 包括在50%活力上下的浓度点

  • 确定IC₅₀值：

    • 如可能，计算IC₅₀(+Irr)和IC₅₀(-Irr)
    • IC₅₀应基于适当的曲线拟合
    • 95%置信区间应合理

  • 浓度范围选择：

    • 最高测试浓度：≤ 1000 μg/mL
    • 对于溶解度有限的化学品：使用最高可达到浓度
    • 应覆盖从无毒性到完全毒性（100%抑制）的范围

1.2 数据点要求

  • 捕获有光照和无光照条件下的浓度-响应关系
  • 如可能，确定IC₅₀值
  • 包括在50%活力上下的浓度点

2. 细胞活力计算

$ 相对活力(%) = $

3. 浓度-响应曲线拟合

  • 使用适当的连续浓度-响应曲线（模型）近似离散数据
  • 通过非线性回归方法进行拟合
  • 推荐使用bootstrap程序评估数据变异性的影响

4. 光毒性指标计算

4.1 光刺激因子（PIF）

$ PIF = $

说明：

  • IC₅₀(-Irr)：无光照条件下使活力降低50%的浓度
  • IC₅₀(+Irr)：有光照条件下使活力降低50%的浓度
  • 如无法计算任一IC₅₀，则无法确定PIF

4.2 平均光效应（MPE）

MPE基于完整浓度-响应曲线的比较：

$ MPE = $

其中：

  • \(PE_c\) = 光效应 = \(RE_c \times DE_c\)
  • \(RE_c\)（响应效应）= \(R_c(-Irr) - R_c(+Irr)\)
  • \(DE_c\)（剂量效应）= \(\frac{C/C^*-1}{C/C^*+1}\)
  • \(w_i\)（权重因子）= \(\max\{R_i(+Irr), R_i(-Irr)\}\)

4.3 软件工具

OECD秘书处提供PIF和MPE计算软件包：

  • PhotoTox version 2.0
  • 网址：https://www.oecd.org/en/topics/sub-issues/testing-of-chemicals/software-test-guidelines.html

4.4 软件使用

4.4.1 软件安装

在网页中下载zip文件，然后解压好之后，只能使用Windows系统使用

  • Windows 10 或更高版本
  • 4GB 内存（推荐 8GB）
  • 100MB 可用磁盘空间

安装

  1. 运行 Setup.exe
  2. 按照向导完成安装
  3. 启动软件

4.4.2 新建项目

点击 File → New 或按 Ctrl+N

new project

新建项目

输入： - 项目名称 - 受试物信息 - 测试日期 - 操作员

4.3 输入数据

在面板中选择select source file,进行数据的导入，只能接受96孔板布局的txt文件，不能使用excel文件导入

data input

data input
  • dataset 输入当前数据板号
  • Laboratory 输入试验名称
  • Chemical 是 输入化合物名称和序列号
  • Run 指重复
  • Light 如果该板是UV就勾选，如果不是就不勾选，用来做比较
  • Toxicitu in vivo:选择是否有毒性

4.4 板子布局

在软件中，布局被默认，主要用来计算，所以要对应上浓度，在Layout中，自己可以edit layout

在输入数据后，默认是没有数据浓度显示的，所以要手动输入自己检测样品的浓度，最少8个样品，并且空白和Control是无法输入浓度的，所以要注意板子的布局

4.5 拟合曲线

输入浓度和数据之后，curve fig会亮起来

curve fit

curve fit

UV+和UV-的两块板子，输入同一个化合物，dataset输入不同的序列号，其它是一致的，然后继续拟合

每次拟合之后，点击Add to project，用来后续计算

Important

不要忘记点击Add to project，否则数据会被覆盖

4.6 计算

将 +UV 和 -UV 实验的数据拟合后，作为两个数据集添加到项目中，就可以对数据进行评估了。

To evaluate the data set pair, open “Pair Evaluation“, and select “Chemical“, “Lab“ and “Pair“ (Run1 or Run2)

pair test

pair test
  • PIF
  • MPE

都会给到直接结果，用来出报告

5. 结果解释

5.1 判读标准（基于验证研究）

根据国际验证研究的统计分析，使用以下标准对光毒性潜力进行分类：

PIF（光刺激因子） MPE（平均光效应） 预测结果 解释
< 2 < 0.1 无光毒性 化学品在光照和无光照条件下毒性无显著差异
≥ 2 且 < 5 ≥ 0.1 且 < 0.15 可疑光毒性 需要进一步评估或重复测试
≥ 5 ≥ 0.15 光毒性 化学品在光照条件下显示显著增强的细胞毒性

重要说明：

  1. PIF和MPE应同时考虑：通常两者给出一致的结果。如果不一致，应采取保守方法，将结果归类为”可疑光毒性”并进一步调查。

  2. 优先使用PIF：当IC₅₀值可以可靠计算时，PIF是首选指标。

  3. MPE的应用：当浓度-响应曲线形状使得IC₅₀难以精确定义时，MPE特别有用。

PDF参考页码：OECD TG 432 (2019) - 第36-37页

5.2 决策标准的详细定义

5.2.1 光刺激因子（PIF）

定义：

$ PIF = $

其中： - \(IC_{50}(-Irr)\) = 无光照条件下使细胞活力降低50%的化学品浓度 - \(IC_{50}(+Irr)\) = 有光照条件下使细胞活力降低50%的化学品浓度

解释：

  • PIF = 1：光照对毒性无影响
  • PIF > 1：光照增强毒性（值越大，光毒性越强）
  • PIF < 1：光照降低毒性（罕见，可能由于光降解）

计算要求：

  • IC₅₀值必须通过适当的非线性回归方法计算
  • 应报告95%置信区间
  • 仅当R²（拟合优度）≥ 0.85时，PIF值才被认为是可靠的

如果一个化合物光照(+Irr)有细胞毒性，而光照情况下无细胞毒性，即使试验结果表明可能具有潜在光毒性，也无法计算PIF，这种情况下，如果用受试物最高浓度(Cmax)进行无光照下的细胞毒性试验，可通过

$ >pIF = $

如果化合物在有光照和无光照都不表现为细胞毒性，则用PIF=1表示

5.2.2 平均光效应（MPE）

定义：

MPE基于完整浓度-响应曲线的比较，而不仅仅是IC₅₀点：

$ MPE = $

其中： - \(n\) = 浓度点数量 - \(w_i\) = 权重因子 = \(\max\{R_i(+Irr), R_i(-Irr)\}\)（最大响应值） - \(PE_c\) = 光效应 = \(RE_c \times DE_c\)

响应效应（Response Effect, RE）：

$ RE_c = R_c(-Irr) - R_c(+Irr) $

其中： - \(R_c(-Irr)\) = 无光照条件下浓度c处的相对活力（%） - \(R_c(+Irr)\) = 有光照条件下浓度c处的相对活力（%）

剂量效应（Dose Effect, DE）：

$ DE_c = $

其中： - \(C\) = 当前浓度 - \(C^*\) = 相对活力降至50%的浓度（IC₅₀的近似值）

解释：

  • MPE = 0：在整个浓度范围内无光毒性效应
  • 0 < MPE < 0.1：轻微或无光毒性
  • 0.1 ≤ MPE < 0.15：可疑光毒性
  • MPE ≥ 0.15：明确的光毒性

MPE的优势：

  • 使用所有数据点，而不仅仅是IC₅₀
  • 对曲线形状变化更敏感
  • 适用于异常的浓度-响应曲线

5.2.3 软件工具

OECD提供PIF和MPE计算软件包：

  • PhotoTox version 2.0
  • 下载地址：https://www.oecd.org/en/topics/sub-issues/testing-of-chemicals/software-test-guidelines.html
  • 功能：
    • 自动计算PIF和MPE
    • 提供bootstrap统计分析
    • 生成浓度-响应曲线图
    • 评估数据质量

注意：该软件不是MAD（数据相互接受）体系的一部分，仅供参考使用。

5.3 特殊情况处理

5.3.1 仅在最高浓度观察到光毒性

情况描述：

  • 光毒性效应（PIF > 2）仅在最高测试浓度观察到
  • IC₅₀(+Irr)接近或等于最高测试浓度

评估流程：

  1. 检查实验充分性：

    • 最高测试浓度是否达到最大可行浓度？
    • 是否因溶解度限制而无法测试更高浓度？

  2. 评估暴露相关性：

    • 该浓度是否显著高于预期的人体暴露水平？
    • 是否有皮肤吸收数据？

  3. 风险决策：

    评估结果 建议措施
    最高浓度 >> 暴露水平 + 低皮肤吸收 可能无实际风险，考虑阴性
    最高浓度 ≈ 暴露水平 + 高皮肤吸收 需要进一步评估
    未知暴露或吸收 进行补充测试

  4. 补充测试选项：

    • ROS（活性氧）生成试验
    • 3D重组人皮肤模型测试
    • 皮肤渗透研究
    • 体外动物或人体皮肤试验

5.3.2 可疑/边界/不清楚的结果

情况描述：

  • PIF在2-5之间，或MPE在0.1-0.15之间
  • 测试条件不理想（如晶体形成、溶剂毒性等）
  • PIF和MPE结果不一致

处理建议：

  1. 首先检查测试质量：

    • 所有接受标准是否满足？
    • 是否有技术问题（如污染、设备故障）？
    • 数据质量是否良好？

  2. 考虑重复测试：

    • 使用改进的实验条件
    • 调整浓度范围
    • 验证试剂质量

  3. 调整实验参数：

    可调整的参数 建议调整 适用情况
    浓度范围 扩宽或缩窄 初始范围未覆盖完整毒性范围
    浓度间距 使用更小的稀释因子 需要更精确的IC₅₀
    培养时间 延长至18-24小时标准 标准化要求
    照射时间 缩短至30-40分钟 水不稳定性化学品

  4. 进行确认性测试：

    • 使用不同阳性对照验证系统性能
    • 使用其他体外方法（如RSM）
    • 考虑3D皮肤模型测试

5.3.3 PIF无法计算的情况

情况描述：

  • 在有光照或无光照条件下未达到50%抑制
  • IC₅₀无法准确计算
  • 浓度-响应曲线平坦或不完整

处理建议：

  1. 使用MPE指标：
    • MPE不需要IC₅₀值
    • 基于完整曲线比较
  2. 如果MPE也无法计算：
    • 评估是否在最高浓度观察到显著差异（> 20%活力差异）
    • 如观察到显著差异，进行重复测试以确认
  3. 调整测试设计：
    • 扩大浓度范围
    • 增加浓度点数
    • 提高最高测试浓度（如果溶解度允许）

5.4 方法学局限性

5.4.1 皮肤吸收数据的重要性

为什么重要：

  • 本测试评估的是化学品的固有光毒性潜力
  • 实际风险还取决于皮肤吸收率
  • 低皮肤吸收的强光毒物可能实际风险很低

建议：

  • 对于阳性结果，应审查皮肤吸收数据
  • 如果无可用数据，考虑进行皮肤渗透研究
  • 在风险评估中整合皮肤吸收因素

5.4.2 代谢激活的考虑

局限性：

  • 本测试不包含代谢系统
  • 主要通过代谢激活产生光毒性的化学品可能被误判为阴性

识别高危化学品：

  • 已知需要代谢激活的化学结构类别
  • 前体药物或前化学品
  • 需要生物转化的农药等

建议：

  • 如果怀疑代谢激活，考虑：
    • 使用添加S9混合物的体外测试
    • 进行体内测试（仅在体外测试不可行时）

5.4.3 光降解的影响

问题：

  • 某些化学品在测试期间可能快速光降解
  • 降解产物可能具有不同的毒性特性

迹象：

  • 测试溶液颜色变化
  • 异常的浓度-响应曲线（如高浓度反而低毒性）
  • 已知光不稳定性

建议：

  • 对于已知光不稳定性化学品：
    • 考虑缩短照射时间
    • 在报告中注明光不稳定性
    • 谨慎解释结果

5.5 测试流程图（完整版）

flowchart TD
    A[开始：测试化学品] --> B{UV/vis MEC > 1000?}
    B -->|否| Z[结论：无光毒性潜力<br/>无需进一步测试]
    B -->|是| C[进行体外3T3 NRU光毒性测试]

    C --> D[准备细胞和化学品]
    D --> E[第1天：细胞铺板 1×10⁴ cells/孔]
    E --> F[18-24 h培养至50%汇合]

    F --> G[第2天：化学品处理]
    G --> H[60分钟暗培养]
    H --> I{分板}

    I --> J[+Irr板：5 J/cm² UVA照射]
    I --> K[-Irr板：暗处50分钟]

    J --> L[洗涤 + 新鲜培养基]
    K --> L

    L --> M[18-24 h恢复培养]

    M --> N[第3天：中性红摄取测定]
    N --> O[3小时NR培养]
    O --> P[提取 + 测定OD540]

    P --> Q[数据分析]

    Q --> R{检查接受标准}
    R -->|未满足| S[测试无效<br/>识别原因并纠正]
    S --> C

    R -->|满足| T[计算相对活力]

    T --> U{能计算IC50?}
    U -->|是| V[计算PIF = IC50-Irr/IC50+Irr]
    U -->|否| W[计算MPE]

    V --> X{PIF < 2?}
    X -->|是| Y[结论：无光毒性]
    X -->|否| AA{PIF ≥ 5?}

    AA -->|是| AB[结论：光毒性]
    AA -->|否| AC[结论：可疑光毒性<br/>需进一步评估]

    W --> AD{MPE < 0.1?}
    AD -->|是| Y
    AD -->|否| AE{MPE ≥ 0.15?}

    AE -->|是| AB
    AE -->|否| AC

    Y --> AF[生成测试报告]
    AB --> AF
    AC --> AG[考虑补充测试或重复测试]
    AG --> AF

质量控制

1. 细胞质量控制

1.1 支原体检测

  • 细胞到达实验室时检测
  • 仅当阴性时使用

1.2 UV敏感性检查

  • 对工作细胞库至少检查一次
  • 在最高使用代次进行测试
  • 使用递增剂量照射（包括高于测试使用的剂量）
  • 证明最高非细胞毒性剂量（5 J/cm²）足以正确分类能力验证化学品

1.3 历史数据

  • 建立阳性对照的MPE历史数据库
  • 监测实验性能随时间的变化

2. 仪器质量控制

2.1 光源

  • 每次测试前使用UVA计检查辐照强度
  • 通过实际使用的板盖类型测量
  • 定期使用外部校准的光谱辐射计

2.2 培养箱

  • 每日记录温度和CO₂浓度
  • 定期清洁和校准

2.3 酶标仪

  • 定期校准波长和吸光度准确性
  • 使用标准溶液验证

4. 能力验证

初次建立本实验的实验室应测试能力验证化学品（表1）：

化学品 CAS号 预期PIF 预期MPE 光毒性
胺碘酮HCl 19774-82-4 >3.25 0.27-0.54 是
氯丙嗪HCl 69-09-0 >14.4 0.33-0.63 是
诺氟沙星 70458-96-7 >71.6 0.34-0.90 是
蒽 120-12-7 >18.5 0.19-0.81 是
原卟啉IX二钠 50865-01-5 >45.3 0.54-0.74 是
L-组氨酸 70-00-4 <1 0.05-0.10 否
六氯酚 70-30-4 1.0-1.7 0.00-0.05 否
十二烷基硫酸钠 151-21-3 1.0-1.9 0.00-0.05 否

测试报告

测试报告应包括以下信息：

1. 受试化学品

  • 识别数据、通用名、IUPAC名和CAS号（如已知）
  • 物理性质和纯度
  • 与研究相关的物理化学性质
  • UV/vis吸收光谱
  • 稳定性和光稳定性（如已知）

2. 溶剂

  • 选择溶剂的理由
  • 受试化学品在溶剂中的溶解度
  • 处理培养基中溶剂的百分比

3. 细胞

  • 细胞类型和来源
  • 无支原体和其他污染
  • 细胞传代代次
  • 使用照射设备测定的特定代次范围细胞的辐射敏感性

4. 测试条件（1）：处理前和处理后培养

  • 培养基类型和组成
  • 培养条件（CO₂浓度、温度、湿度）
  • 培养持续时间（处理前、处理后）

5. 测试条件（2）：化学品处理

  • 选择有光照和无光照条件下受试化学品浓度的理由
  • 受试化学品溶解度有限且无细胞毒性时：选择最高测试浓度的理由
  • 处理培养基类型和组成（缓冲盐溶液）
  • 化学品处理持续时间

6. 测试条件（3）：照射

  • 选择所用光源的理由
  • 光源制造商和类型、辐射计
  • 光源光谱辐照度特性
  • 所用滤光器的透射和吸收特性
  • 辐射计特性及其校准详情
  • 光源与测试系统的距离
  • 该距离下的UVA辐照度（mW/cm²）
  • UV/vis光暴露持续时间
  • UVA剂量（辐照度×时间，J/cm²）
  • 照射期间和同期暗处保存的细胞培养温度

7. 测试条件（4）：中性红活力测试

  • 中性红处理培养基组成
  • 中性红培养持续时间
  • 培养条件（CO₂浓度、温度、湿度）
  • 中性红提取条件（提取剂、持续时间）
  • 分光光度计读数波长
  • 第二波长（参考）（如使用）
  • 酶标仪空白内容（如使用）

8. 结果

  • 受试化学品各浓度下的细胞活力，表示为平均同时溶剂对照活力的百分比
  • 同时进行的+Irr和-Irr实验获得的浓度-响应曲线
  • 浓度-响应曲线分析：如可能，计算IC₅₀(+Irr)和IC₅₀(-Irr)
  • 比较有光照和无光照条件下获得的两条浓度-响应曲线：
    • 通过计算光抑制因子（PIF）
    • 和/或通过计算平均光效应（MPE）（取决于剂量-响应曲线）
  • 测试接受标准；同时溶剂对照：
    • 照射和非照射细胞的绝对活力（中性红提取物的光密度）
    • 历史阴性和溶剂对照数据；均值和标准差
  • 测试接受标准；同时阳性对照：
    • 阳性对照化学品的IC₅₀(+Irr)和IC₅₀(-Irr)及PIF/MPE
    • 历史阳性对照化学品数据：IC₅₀(+Irr)和IC₅₀(-Irr)及PIF/MPE；均值和标准差

附录

附录A：完整的决策标准流程图

flowchart TD
    A[完成测试：获得原始OD540数据] --> B[计算相对活力]
    B --> C[绘制浓度-响应曲线]

    C --> D{数据质量检查}
    D -->|任一接受标准未满足| E[测试无效<br/>调查原因并重复测试]
    E --> A

    D -->|所有接受标准满足| F[确定可计算IC50?]

    F -->|是| G[计算IC50-Irr和IC50+Irr]
    F -->|否| H[使用MPE方法]

    G --> I[计算PIF = IC50-Irr/IC50+Irr]
    I --> J{PIF值评估}

    J -->|PIF < 2| K[结论：无光毒性]
    J -->|PIF ≥ 5| L[结论：光毒性]
    J -->|2 ≤ PIF < 5| M[可疑结果]

    H --> N[计算MPE值]
    N --> O{MPE值评估}

    O -->|MPE < 0.1| K
    O -->|MPE ≥ 0.15| L
    O -->|0.1 ≤ MPE < 0.15| M

    M --> P{是否仅在最高浓度?}
    P -->|是| Q[评估暴露相关性]
    Q --> R{皮肤吸收低?}
    R -->|是| S[可能无实际风险]
    R -->|否/未知| T[考虑补充测试]

    P -->|否| T
    T --> U[重复测试或补充研究]

    K --> V[生成测试报告]
    L --> V
    S --> V
    U --> V

附录B：PIF和MPE计算示例

B.1 计算步骤示例

示例1：使用PIF判断

原始数据：

浓度（μg/mL） OD540 (+Irr) OD540 (-Irr)
0（溶剂对照） 1.20 1.18
0.1 1.15 1.16
0.3 0.95 1.12
1.0 0.60 1.05
3.0 0.25 0.85
10.0 0.10 0.55
30.0 0.05 0.30

步骤1：计算相对活力

相对活力(%) = (OD测试 - OD空白) / (OD溶剂对照 - OD空白) × 100

假设OD空白 = 0.05

步骤2：通过非线性回归确定IC₅₀

使用适当的软件（如PhotoTox、GraphPad Prism）进行曲线拟合：

  • IC₅₀(+Irr) = 1.8 μg/mL
  • IC₅₀(-Irr) = 28.5 μg/mL

步骤3：计算PIF

PIF = IC₅₀(-Irr) / IC₅₀(+Irr) = 28.5 / 1.8 = 15.8

步骤4：判断

PIF = 15.8 > 5 → 光毒性阳性

示例2：使用MPE判断

当IC₅₀难以准确计算时，使用MPE：

相对活力数据：

浓度（C） C/C* R(+Irr) R(-Irr) RE DE PE w
0.3 0.05 95 97 2 -0.90 -1.80 97
1.0 0.17 80 95 15 -0.71 -10.65 95
3.0 0.50 45 85 40 -0.33 -13.20 85
10.0 1.67 15 50 35 0.25 8.75 50
30.0 5.00 5 15 10 0.67 6.70 15

其中C* = IC₅₀(+Irr) ≈ 6 μg/mL（近似值）

计算MPE：

分子 = Σ(w × PE) = 97×(-1.80) + 95×(-10.65) + 85×(-13.20) + 50×8.75 + 15×6.70 = -174.6 - 1011.75 - 1122 + 437.5 + 100.5 = -1770.35

分母 = Σw = 97 + 95 + 85 + 50 + 15 = 342

MPE = -1770.35 / 342 = -5.18（绝对值通常报告）

|MPE| = 5.18 > 0.15 → 光毒性阳性

B.2 Bootstrap方法简介

目的：评估IC₅₀、PIF和MPE的变异性

方法：

  1. 从原始数据中进行重复抽样（bootstrap重采样）
  2. 对每个bootstrap样本计算PIF/MPE
  3. 重复1000-10000次
  4. 计算PIF/MPE的分布：
    • 均值
    • 标准差
    • 95%置信区间

优势：

  • 不假设数据分布
  • 提供可靠的不确定性估计
  • 适用于小样本量

附录C：PhotoTox软件使用指南

C.1 软件概述

PhotoTox version 2.0是OECD提供的专门用于TG 432数据分析的软件。

主要功能：

  • 计算PIF和MPE值
  • 进行bootstrap统计分析
  • 生成浓度-响应曲线图
  • 评估数据质量和接受标准

C.2 软件获取

  • 下载地址：http://www.oecd.org/env/ehs/testing/section4software.htm
  • 版本：PhotoTox 2.0
  • 系统要求：Windows操作系统
  • 注意：该软件不是MAD（数据相互接受）体系的一部分

C.3 数据输入格式

所需数据：

  1. 浓度数据：所有测试浓度（包括0）
  2. 吸光度数据：
    • 有光照板（+Irr）的OD₅₄₀值
    • 无光照板（-Irr）的OD₅₄₀值
    • 空白对照的OD₅₄₀值
  3. 重复数：每个浓度的平行孔数

数据格式示例：

Concentration(ug/mL)    OD_Irr_Rep1 OD_Irr_Rep2 OD_Irr_Rep3 OD_NoIrr_Rep1   OD_NoIrr_Rep2   OD_NoIrr_Rep3
0.00    1.20    1.18    1.22    1.18    1.20    1.19
0.10    1.15    1.13    1.16    1.16    1.15    1.17
0.30    0.95    0.97    0.93    1.12    1.10    1.14
...

C.4 分析步骤

  1. 导入数据：从文本文件或Excel文件导入
  2. 检查数据质量：
    • 识别异常值
    • 检查重复性
  3. 选择分析模型：
    • 指数模型
    • 线性模型
    • 对数模型
  4. 运行分析：
    • 计算IC₅₀值
    • 计算PIF和MPE
    • 运行bootstrap（可选）
  5. 生成报告：
    • 浓度-响应曲线图
    • 数值结果表
    • 数据质量评估

C.5 结果解释

输出指标：

指标 说明
IC₅₀(+Irr) 光照条件下半抑制浓度及其95% CI
IC₅₀(-Irr) 无光照条件下半抑制浓度及其95% CI
PIF 光刺激因子
PIF 95% CI PIF的95%置信区间
MPE 平均光效应
R² 曲线拟合优度

附录D：验证研究数据摘要

D.1 实验室间验证研究（1996-1998）

参与实验室：11个欧洲实验室

测试化学品：20种（包括10种光毒性物质和10种非光毒性物质）

主要结果：

统计指标 结果
敏感性 100% (10/10)
特异性 80% (8/10)
准确率 90% (18/20)
实验室内CV < 15%
实验室间CV < 25%

D.2 验证化学品的PIF和MPE分布

光毒性化学品（n=10）：

统计量 PIF MPE
均值 25.8 0.42
中位数 18.5 0.38
范围 3.2-71.6 0.19-0.90
SD 22.5 0.21

非光毒性化学品（n=10）：

统计量 PIF MPE
均值 1.3 0.03
中位数 1.2 0.03
范围 0.8-1.9 0.00-0.10
SD 0.4 0.03

D.3 历史对照数据参考范围

基于验证研究和后续实验室经验，建立以下历史对照参考范围：

氯丙嗪（CPZ）：

参数 均值 ± SD 参考范围（均值 ± 2SD）
IC₅₀(+Irr) 0.8 ± 0.5 μg/mL 0.1-2.0 μg/mL
IC₅₀(-Irr) 35 ± 20 μg/mL 7.0-90.0 μg/mL
PIF 45 ± 25 > 6
MPE 0.45 ± 0.12 0.33-0.63

溶剂对照：

参数 参考范围
相对活力（+Irr vs -Irr） 80-120%
OD₅₄₀ ≥ 0.4

附录E：测试流程图

flowchart TD
    A[第1天：细胞铺板] --> B[18-24 h培养<br/>形成50%汇合单层]
    B --> C[第2天：化学品处理]
    C --> D[60分钟暗培养]
    D --> E{分板}
    E --> F[+Irr板：<br/>5 J/cm² UVA照射50分钟]
    E --> G[-Irr板：<br/>室温暗处50分钟]
    F --> H[洗涤 + 新鲜培养基]
    G --> H
    H --> I[18-24 h恢复培养]
    I --> J[第3天：中性红摄取测定]
    J --> K[3小时NR培养]
    K --> L[提取 + 测定OD540]
    L --> M[数据分析：<br/>计算PIF/MPE]
    M --> N[结果判读]

附录F：决策树 - 光毒性测试策略

flowchart TD
    A[评估化学品<br/>物理化学性质] --> B{UV/vis吸收光谱}
    B -->|MEC < 1000 L mol⁻¹ cm⁻¹| C[无需光毒性测试]
    B -->|MEC > 1000 L mol⁻¹ cm⁻¹| D[体外3T3 NRU光毒性测试]
    D --> E{PIF < 2 或 MPE < 0.1}
    E -->|是| F[无光毒性]
    E -->|否| G{PIF > 5 或 MPE > 0.15}
    G -->|是| H[光毒性]
    G -->|否| I[可疑光毒性<br/>需进一步评估]

附录G：阳性对照试剂准备

氯丙嗪（Chlorpromazine）储液制备

1 mg/mL储液（在DMSO中）：

  1. 精确称取10 mg氯丙嗪
  2. 加入10 mL DMSO
  3. 涡旋混合直至完全溶解
  4. 分装至小体积，避光保存于-20°C

工作液制备：

  • 在EBSS/HBSS中稀释至所需浓度范围
  • 保持最终DMSO浓度恒定为1% (v/v)

附录H：记录表格模板

测试记录表

项目 记录
测试日期
操作员
受试化学品
批号
溶剂
细胞系 BALB/c 3T3
细胞代次
铺板密度 1×10⁴ cells/孔
光源类型
UVA辐照度 mW/cm²
照射时间 min
UVA剂量 J/cm²

版本历史

版本 日期 修订内容 修订人
1.0 2024-01-XX 基于OECD TG 432 (2019)创建初版 -